2. 1. 5. Preparación y manejo de soluciones stock

 

2. 1. 5. Preparación y manejo de soluciones stock

La formulación de las sales minerales que se va a emplear es la de Murashige y Skoog (MS, 1962), pensada inicialmente para el cultivo de callos de tabaco. Debido al elevado número de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentración, resulta más práctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace más rápida la futura preparación de medios y minimiza los errores (debidos a las numerosas pesadas de cantidades muy pequeñas). Las soluciones stock, se caracterizan por ser preparaciones concentradas de nutrientes o fitohormonas. Una solución stock puede ser arreglada en diferentes concentraciones según sea requerida y debe ser almacenada en un frasco color ámbar, ya que estos tienen la capacidad de impedir el paso de rayos UV.

Para realizar cálculos sobre soluciones stock el facilitador proporciono la cantidad de g/l de sales y orgánicos que constituyen el medio nutritivo MS (Murashige y Skoog, 1962), que es con el que se trabajara en esta materia, para ello explico que el medio se encuentra concentrado a 1x y a un volumen de 1l. Tabla 1.

Macronutrientes
NH4NO3	1.65 g/l
KNO3	1.9 g/l
MgSO4.7H2O	0.37 g/l
CaCl2.aq	0.33 g/l
KH2PO4	0.17 g/l
Micronutrientes
KI	0.83 mg/l
H3BO3	6.2 mg/l
MnSO4.4H2O	22.3 mg/l
ZnSO4.7H20	8.6 mg/l
Na2MoO4.2H2O	0.25 mg/l
CuSO4.5H2O	0.025 mg/l
CoCl2.6H2O	0.025 mg/l
Na2.EDTA	37.3 mg/l
FeSO4.7H2O	27.8 mg/l

Tabla 1. Macro y micronutrientes que forman las sales y orgánicos del medio MS.

Los primeros ejercicios realizados fueron a una concentración de 100x y a un volumen de 1L. Tabla 2.

Macronutrientes		Concentración	Volumen	Cálculos
NH4NO3	1.650 g/l	100X	1L	1.650 g/l*100X=165 g/l
KNO3	1.900 g/l	100X	1L	1.900 g/l *100X=190 g/l
MgSO4.7H2O	0.370 g/l	100X	1L	0.370 g/l*100X=37 g/l
CaCl2.aq	0.44 g/l	100X	1L	0.44 g/l*100X=40 g/l
KH2PO4	0.170 g/l	100X	1L	0.170 g/l*100X= 17 g/l
Micronutrientes		Concentración	Volumen	Cálculos
KI	0.00083 g/l	100X	1L	0.00083 g/l*100X=0.083 g/l
H3BO3	0.062 g/l	100X	1L	0.062 g/l*100X=6.2 g/l
MnSO4.4H2O	0.0169 g/l	100X	1L	0.0169 g/l*100X=1.69 g/l
ZnSO4.7H20	0.0086 g/l	100X	1L	0.0086 g/l*100X=0.86 g/l
Na2MoO4.2H2O	0.00025 g/l	100X	1L	0.00025 g/l*100X=0.025 g/l
CuSO4.5H2O	0.000025 g/l	100X	1L	0.000025 g/l*100X=0.0025 g/l
CoCl2.6H2O	0.000025 g/l	100X	1L	0.000025 g/l*100X=0.0025 g/l
Na2.EDTA	0.O372 g/l	100X	1L	0.O372 g/l*100X=3.72 g/l
FeSO4.7H2O	0.0278 g/l	100X	1L	0.0278 g/l*100X=2.78 g/l

Los cálculos son el resultado de multiplicar la cantidad de reactivo del medio ms ya preestablecida, por la concentración. Cabe mencionar que los cálculos solo muestran la concentración del reactivo por litro, esto hace alusión a que cuando se requiera preparar una solución stock para un volumen o concentración diferente se debe seguir con el proceso como se muestra en la tabla 3.

Normas generales a la hora de pesar

- Se debe comprobar los cálculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre están expresados para un litro

- Debe leer las características del reactivo que se va a pesar. Algunos son tóxicos por inhalación o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.

- Para medidas desde 0.01 g se utilizará la balanza granataria. Para valores inferiores la balanza analítica.

- Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza, favor de colocar pesa sustancias.

- Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que esté limpia y seca. Es una precaución que evita la contaminación de los reactivos.

- Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tomó.

Normas generales a la hora de preparar las disoluciones

- Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitación es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.

- Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del volumen total de agua.

- Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán uno a uno y teniendo la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté totalmente disuelto.

- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer.

- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los siguientes datos:

·         Tipo de solución. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc.

·         Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la solución final).

·         Componentes con fórmula y peso en g/l.

·         Fecha de preparación.

·         Nombre de los integrantes del equipo.

Bibliografía:

& George E.F. (1993). The components of culture media. En: Plant propagation by tissue culture. Part 1. The technology. Exegetics Ltd, Edington. pp. 273-343.

& Lindsey K. (Ed.) (1991). Plant Tissue Culture Manual. Kluwer Academic Publishers. ISBN: 0-7923-1516-2.

& Margara J. (1988). Multiplicación vegetativa y cultivo in vitro. Ediciones Mundi-Prensa (Madrid). 232 pp. ISBN: 84-7114-185-X.

& Murashige T. and Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-479.